CONCLUSIÓN FINAL DE LA UNIDAD NUMERO 4

A manera de conclusión puedo decir que como en las unidades anteriores se cumplió con los objetivos planteados ya que entendí como se transmite la información genética entre los seres vivos y la relación que presenta con los mecanismos de herencia. También entendí como se transmite la información genética entre los seres vivos y su relación con los mecanismos de herencia.  Y distinguir los mecanismos de duplicación del material genético en procariotas y eucariontes. Así como estudie por igual, el nombre de todas las enzimas presentes en la replicación del ADN tanto en los procariontes y en los eucariontes, y las diferencias que se distinguen entre los dos. Con base a los conocimientos adquiridos pude explicar y esquematizar el proceso y explicar sus diferencias.                                                                                              También pude conocer el proceso de PCR, que es lo que es, que significan sus siglas, y como es el proceso, y las grandes ventajas y como desventajas que presenta.  En esta unidad hubo una práctica y esta me ayudo a conocer cómo es que se rrealiza la extracción y separación del DNA.    Los problemas o dificultades que presente en esta unidad fueron en comprender bien el proceso de replicación, puesto que son varias enzimas las que están relacionas, pero leyendo el tema y comprendiéndolo, puedo decir a manera futura que si puedo explicar este proceso.

                                                                                                                                                                       

4.4.1 SECUENCIACIÓN DEL ADN

Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda, con la capacidad de transportar información.

Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN - adenina, citosina,guanina, timina, que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. En el típico caso, las secuencias se presentan pegadas unas a las otras, sin espacios, como en la secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a 3' de izq. a derecha.

Una sucesión de cualquier número de nucleótidos mayor a cuatro es pasible de llamarse una secuencia. En relación a su función biológica, que puede depender del contexto, una secuencia puede tener sentido o antisentido, y ser tanto codificante o no codificante. Las secuencias de ADN pueden contener "ADN no codificante."

Las secuencias pueden derivarse de material biológico de descarte a través del proceso de secuenciación de ADN.

En algunos casos especiales, las letras seguidas de A, T, C, y G se presentan en una secuencia. Esas letras representan ambiguedad. De todas las moléculas muestreadas, hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. Las reglas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:

A = adenina

C = citosina

G = guanina

T = timina

R = G A (purina)

Y = T C (pirimidina)

K = G T (keto)

M = A C (amino)

S = G C (enlaces fuertes)

W = A T (enlaces débiles)

B = G T C (todos y A)

D = G A T (todos y C)

H = A C T (todos y G)

V = G C A (todos y T)

N = A G C T (cualquiera) 

La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos. 

Bibliografía:

 

Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 1975 Mayo 25;94(3):441–448 

4.4 REPLICACIÓN IN VITRO DEL ADN (PCR)

 

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la copia in vitro de secuencias específicas de DNA y que ha revolucionado el campo de la Biología Molecular. Conceptualmente, la PCR es una técnica sencilla, consiste en la separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere amplificar, y su copia simultánea a partir de un punto, determinado por un fragmento de DNA artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima denominada DNA polimerasa. El resultado es la duplicación del número de moléculas de una secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un número determinado de veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificación exponencial del número de copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si partimos de una molécula única de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se duplica el número de moléculas, teóricamente, al final de los 30 ciclos, se obtendrán 2³⁰ moléculas idénticas, es decir 1073741824 moléculas.

La gran ventaja de la PCR es que amplifica únicamente el fragmento de DNA que queremos aunque esté en cantidades mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La reacción es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia de otros componentes.

La PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigación (clonado de genes, detección de clones recombinantes, estudio de DNA de fósiles), medicina forense y criminalística (determinación de la paternidad, identificación de individuos, identificación sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violación, etc.), sanidad animal y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza de razas, etc.) y medicina (diagnóstico de enfermedades). La PCR fue desarrollada por Kary Mullis (Saiki et al, 1985; Mullis, 1990) en 1985, utilizando como DNA polimerasa el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando los tubos de reacción en cada ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC (desnaturalización) y 37 ºC (hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a la PCR en una técnica tediosa y costosa.

Bibliografía:

http://quimicoclinico.wordpress.com/2008/03/27/anticuerpos-contra-vih/ 

4.3. CONTROL DE LA REPLICACIÓN

 

El proceso resultante de la duplicación de ADN se conoce como división celular, la cual se ha estudiado a nivel citológico estableciéndose ciertas pautas cubiertas por lo que se conoce como ciclo celular.

El proceso resultante de la duplicación de ADN se conoce como división celular, la cual se ha estudiado a nivel citológico estableciéndose ciertas pautas cubiertas por lo que se conoce como ciclo celular.

Las células de los distintos organismos pasan durante su vida por distintos períodos, cada uno de ellos característico y claramente diferenciado.

Cada tipo celular cumple con sus funciones específicas durante la mayor parte de su vida, creciendo gracias a la asimilación de materiales provenientes de su ambiente y con ellos sintetiza nuevas moléculas por medio de complejos procesos regulados por su material genético.

Cuando una célula aumenta hasta llegar a un determinado tamaño, su eficiencia metabólica se torna crítica, entonces se divide. En los organismos pluricelulares, se produce un crecimiento a partir de una célula (huevo o cigoto) como así también se aumenta la masa tisular y se reparan los tejidos lesionados o desgastados, por aumento del número de células.

Las nuevas células originadas en esta división poseen una estructura y función similares a las células progenitoras, o bien derivadas de ellas.

                                                 

El cromosoma de la bacteria intestinal Escherichia coli es único, circular y contiene cerca de 4.7 millones de pares de bases. Tiene cerca de 1 mm de longitud pero solo 2 nm de ancho. El cromosoma se replica produciendo una figura que asemeja a la letra griega theta.

El promotor es la parte del ADN en donde se pega la ARN polimerasa antes de abrir el segmento de ADN a ser transcripto.

Un segmento del ADN que codifica para un polipéptido específico se conoce como un gen estructural . Escherichia coli puede sintetizar 1700 enzimas, por lo tanto esta pequeña bacteria tiene genes para 1700 mARN.

                                           

La lactosa, el azúcar de la leche, es hidrolizado por la enzima beta-galactosidasa. Esta enzima es inducible, solo se produce en grandes cantidades cuando la lactosa, el sustrato sobre el cual opera, esta presente. En cambio, las enzimas para la síntesis del aminoácido triptófano se producen continuamente a menos que el triptófano este presente en el medio de cultivo, se dice en este caso que las enzimas sintetizadoras de triptófano estan reprimidas.

Bibliografía:

http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema3.htm 

PRÁCTICA NUMERO 1: EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE DNA

RESUMEN

ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico. Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.

El ADN fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, biólogo suizo, en los núcleos de las células del pus obtenidas de los vendajes quirúrgicos desechados y en el esperma del salmón. Él llamó a la sustancia nucleína, aunque no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery

La estructura del ADN es una pareja de largas cadenas de nucleótidos. La estructura de doble hélice del ADN fue descubierta en 1953 por James Watson y Francis Crick. Una larga hebra de ácido nucleico está enrollada alrededor de otra hebra formando un par entrelazado. Dicha hélice mide 3,4 nm de paso de rosca y 2,37 nm de diámetro, y está formada, en cada vuelta, por 10,4 pares de nucleótidos enfrentados entre sí por sus bases nitrogenadas. Por medio de la realización de la práctica se pudo hacer este trabajo el cual, nos enseña y aprendimos a como extraer ADN y a como separarlo por técnicas sencillas. Con ayuda del manual de práctica pudimos realizar los pasos y hacer posible dicho trabajo

ABSTRACT

DNA stands for deoxyribonucleic acid. Is the genetic material of organisms. It is theprimary chemical component of chromosomes and the material of which genes are made.

DNA extraction requires a series of basic stages. First they have to break the cell wall and the plasma membrane to access the cell nucleus. Then you must alsobreak the nuclear membrane to free DNA. Finally we should protect DNA fromenzymes that can degrade and isolate it needs to be done to precipitate in alcohol.

The DNA was first identified in 1868 by Friedrich Miescher, Swiss biologist, in the nuclei of pus cells obtained from discarded surgical bandages and salmon sperm.He called the substance nuclein, but was not recognized until 1943 thanks to theexperiment by Oswald Avery.

The DNA structure is a pair of long chains of nucleotides. The double helix structureof DNA was discovered in 1953 by James Watson and Francis Crick. A longnucleic acid strand is wound around another strand forming a twisted pair. Suchmeasures 3.4 nm helix pitch and 2.37 nm in diameter, and consists, at every turn,by 10.4 nucleotide pairs facing each other by their nitrogenous bases. Through the implementation of practice could make this work which, we are taughtand learned how to extract DNA and separate it as simple techniques. Using themanual we were able to practice the steps and make such work possible.

ÍNDICE.

Antecedentes

Definición del problema.

Objetivo  General

Objetivos Específicos

Justificación.

Fundamento teórico

Materiales y Métodos.

Resultados.

Conclusiones y Recomendaciones.

Fuentes consultadas

Anexos. 

ANTECEDENTES

Además del agua, los carbohidratos, las proteínas y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, en menos cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

Los ácidos nucleícos (DNA y RNA) Son biomoleculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas. Son moléculas complejas producidas por las células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características específicas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteínas.

La extracción de ADN de los tejidos de las plantas, a diferencia de aislamiento de ADN de tejidos de mamíferos, sigue siendo difícil debido a la presencia de una pared celular rígida que rodea las células vegetales. Actualmente se utilizan métodos exigen necesariamente una laboriosa trituración mecánica paso, necesario para interrumpir la pared celular para la liberación de ADN. El campo de la biología molecular de plantas es, por lo tanto, en una situación de desventaja, especialmente cuando un sistema automatizado de alto rendimiento para el sistema de aislamiento de PCR-Ready se requiere el ADN genómico en la genética de poblaciones, la identificación de las especies, la diversidad biológica de investigación, la selección de detección, de control de los alimentos y la biotecnología vegetal. QIAGEN GmbH ha desarrollado un 96-así moler método (MagAttract 96 Planta kit), pero se requiere de un molino mezclador especial, un paso centrifugación y, en consecuencia, no está plenamente automatable

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

En los organismos superiores el ADN es único e invariable, a lo largo de toda la vida, para cada individuo de cada especie. Esta característica es lo que se conoce como "huella genética", y es la base de los estudios de identificación de individuos. Salvo unas pocas excepciones (glóbulos rojos en mamíferos, por ejemplo), todas las células de un organismo vivo tienen ADN. Gracias a ello es posible extraerlo a partir de cualquier muestra biológica.

OBJETIVO GENERAL

Extraer DNA y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

• Utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto natural.
• Observar la estructura del ADN 

JUSTIFICACIÓN.

Esta práctica se realizo con el fin de extraer ADN, y también para poder conocer técnicas sencillas para dicha extracción, y conocer para que es importante extraerlo.Ya que como estudiante de Biología, es indispensable conocer como se extrae el ADN y como es dicho proceso, ya que esto nos beneficiara en las siguientes practicas que tendremos y a futuro en nuestra carrera.

FUNDAMENTO TEÓRICO

La práctica se realizo mediante un manual que el profesor nos proporciono, este se basaba de varios pasos que nos guiaban a como realizar esta práctica, y esos son los siguientes:

A) Rompimiento de membranas y pared celulares.

Toma una muestra del tejido (5 gr Aprox) que hayas eligido y homogenízalo, es decir muelelo con el mortero, si el tejido es muy duro, si el tejido es muy duro licualo en seco.

B) Digestion

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox),  en un tubo de eppendorf de 1 ml y agrégale el Buffer de extracion (Tris- HCL 0.05 M, EDTA, 0,02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7 M)  a temperatura de cuarto (500 ul aprox).

Cuando hayas agregado el Buffer de extracción a tu muestra, agítala e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

C) Separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agrégale 500 ul. de Fenol/Cloroformo/Isopropanol frio usa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 min.

Extrae la fase acuosa (500 ul.) con una micropipeta, si no se separan las fases centrifuga a 3000 rpm por 10 min, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

D) Precipitación de Ácidos nucleicos DNA y RNA

A la fase acuosa que extrae (500 ul), colocala en un tubo de eppendorf limpio y agrégale 400 ul de etanol (100 %) frio y 75 ul de NaCl 3 M. Mezcla por inversión, suave y observa como se precipita el DNA.

D) Recuperacion de la pastilla.

Centrifuga tu tubo por 5 min a 3000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.

E) Resuspension.

Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Los materiales que se ocuparon para realizar la practica son los siguientes:

*Tubos de centifruga 1ml

*Tubos de ensayo de 5ml

*Centrifuga

*MicroPipetas de 1000 y 200 ul

*Agua Destilada estéril (20 ml para todos)

*Etanol al 100% frio (20 ml para todos)

*NaCl 3M

*Buffer de extracción de ADN (Urea, Nacl, EDTA, (20 ml para todos)

*Fenol/Cloroformo/Isopranol frió. (20 ml para todos)

*Mortero y pistilo

*Aguacate, cacahuate, hojas, carne, hígado, sangre.

*Papel aluminio

*Ceenpack

*Guantes
En cuanto al método que nos basamos en realizar fue con la ayuda del manual que nos proporciono el profesor para dicha practica.

RESULTADOS

A) Rompimiento de membranas y pared celulares.

Toma una muestra del tejido (5 gr Aprox) que hayas eligido y homogenízalo, es decir muelelo con el mortero, si el tejido es muy duro, si el tejido es muy duro licualo en seco.

B) Digestion

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox),  en un tubo de eppendorf de 1 ml y agrégale el Buffer de extracion (Tris- HCL 0.05 M, EDTA, 0,02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7 M)  a temperatura de cuarto (500 ul aprox).

Cuando hayas agregado el Buffer de extracción a tu muestra, agítala e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

C) Separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agrégale 500 ul. de Fenol/Cloroformo/Isopropanol frio usa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 min.

Extrae la fase acuosa (500 ul.) con una micropipeta, si no se separan las fases centrifuga a 3000 rpm por 10 min, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

D) Precipitación de Ácidos nucleicos DNA y RNA

A la fase acuosa que extrae (500 ul), colocala en un tubo de eppendorf limpio y agrégale 400 ul de etanol (100 %) frio y 75 ul de NaCl 3 M. Mezcla por inversión, suave y observa como se precipita el DNA.

D) Recuperacion de la pastilla.

Centrifuga tu tubo por 5 min a 3000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.

E) Resuspension.

Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.

En conclusión, puedo decir que con la realización de esta práctica se cumplió con los objetivos, ya que se extrajo DNA y RNA de tejidos animales y lo identificarlos como tales. También utilizamos unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto natural. Y observar la estructura del ADN. Una recomendación seria que cuando se añade el alcohol frío se  debe hacerlo de forma cuidadosa y no inhalar los vapores ya que este es dañino para la salud y conlleva graves consecuencias.

FUENTES CONSULTADAS

http://www.educ.ar/educar/tecnologia-del-adn-recombinante.html 

http://www.geneticaycancer.es/doc.phpop=molecular&ap=tecnicas_molecular&id=8 

ANEXOS

CUESTIONARIO

1. ¿Porque el DNA en solución se precipita en presencia de un alcohol frió?

Porque la solución forma complejos con los lípidos y las proteínas, permitiendo que los mismos sean separados del ADN por filtración. Así se libera el ADN. La sal permite que el ADN precipite en una solución fría de alcohol y que las cadenas de ADN no se corten. 

2.¿Como separamos de nuestra muestra el DNA del RNA?

Por medio de la centrifugación.

3.¿Cuál es la función del Cloroformo?

La separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos.

4.¿Cómo podrías cuantificar la cantidad de DNA de tu muestra?

La cantidad de ADN leído se mide en número de bases nucleotídicas, así se pueden encontrar unidades de medición como las "kilobases" (una kilobase = mil bases de ADN leídas).

5. ¿Cuál es su función y la importancia del DNA en los organismos?

La importancia del ADN se deriva de sus funciones y algunas de ellas son:

Almacenamiento de información (genes y genoma )

Codificación de proteínas (transcripción y traducción ) 

Autoduplicación (replicación del ADN ) para asegurar la transmisión de la información a las células hijas durante la división celular.  El ADN controla la actividad de la célula.

Y en ciertos casos, comúnmente derivados del caso anterior, el ADN puede llegar a tener cierta conductividad, según un estudio realizado.

PORTADA

NSTITUTO TECNOLOGICO DE CD. ALTAMIRANO GRO

LIC: BIOLOGIA

MATERIA:

BIOLOGÍA MOLECULAR

PRÁCTICA NUMERO 1

"EXTRACIÓN Y SEPARACIÓN DE DNA”

NOMBRE DE LA ALUMNA:

ALEXA MOLINA VALENZUELA

09930047

SEMESTRE Y GRUPO:

Vl SEMESTRE “A”

NOMBRE DEL PROFESOR:

FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

CD.ALTAMIRANO, GRO     15 /MARZO/2012 

4.2. REPLICACIÓN DEL DNA EN EUCARIONTES.

Es algo similar a la replicación de los Procariontes puesto con algunas pequeñas complicaciones que son:

EL DNA en eucariontes se organiza en varios cromosomas lineales, y este es mas largo.

EL movimiento del DNA polimerasa es mucho más lento, y esto permite que se forme un numero mayor de horquillas de replicación.

También se forman fragmentos de okazaki pero mas pequeños.

Y el final de la replicación tiene que resolver el problema del acortamiento de los cromosomas, para ello ha desarrollado la estructura de los telómeros y telosomas, y la actuación de una nueva enzima llamada Teloromesara.

Diferencias de la Replicacion en Procariontes y Eucariontes:

PROCARIONTES	EUCARIONTES
Un solo origen de replicación	Tiene multiples orígenes de replicación
Una burbuja de replicación	Presenta varias burbujas de replicación
El ADN es corto	La topoisomerasa trabaja más porque el ADN esta superdesarrollado
El movimiento de la DNA polimerasa es rápido	EL movimiento de la DNA polimerasa es más lento
La replicación es mas lenta	La replicación es más rápida
Fragmentos de okazaki largos	Frangmentos de okazaki mas cortos

Bibliografía:

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm