jueves, 2 de febrero de 2012

1.1.3 EL DESCUBRIMIENTO DEL CÓDIGO GENÉTICO

Desde que se demostró que las proteínas eran producto de los genes, y que cada gen estaba formado por fracciones de cadenas de ADN, los científicos llegaron a la conclusión de que debe haber un código genético mediante el cual el orden de las cuatro bases nitrogenadas en el ADN podría determinar la secuencia de aminoácidos en la formación de polipéptidos. Enotras palabras, debe haber un proceso mediante el cual las bases nitrogenadas transmitan la información que dicta la síntesis de proteínas.

La estructura tridimensional de la molécula de ADN fue demostrada por James D. Watson y Francis Crick en 1953. Pero faltaba averiguar cómo interpreta el organismo la secuencia de las distintas bases que forman la estructura lineal del ADN para sintetizar las cadenas de aminoácidos de las proteínas. La solución a este enigma, el código genético, se halló en 1966 gracias a la colaboración entre numerosos investigadores, entre ellos Marshall Nirenberg.

Diez años después de que Watson y Crick determinaran la estructura del ADN, el código genético fue descifrado y verificado. Su solución dependió en gran medida de las investigaciones llevadas a cabo sobre otro grupo de ácidos nucleicos, los ácidos ribonucleicos (ARN). Se observó que la obtención de un polipéptido a partir del ADN se producía de forma indirecta a través de una molécula intermedia conocida como ARN mensajero (ARNm).

El código genético asocia a cada triplete de bases del ADN, llamado codón, un aminoácido concreto. Con los cuatro tipos de bases (U, uracilo; A, adenina; G, guanina; y C, citosina) que forman la molécula de ARN, sintetizada de manera complementaria a partir de la de ADN, se pueden formar 64 tripletes distintos (por ejemplo, UAC, UGG y AUC, entre otros). Cada codón se atribuye a un aminoácido concreto de los veinte posibles sin ninguna ambigüedad. Como hay menos aminoácidos que codones, algunos de aquéllos quedan designados por varios de éstos. Así, los seis tripletes UUA, UUG, CUU, CUC, CUA y CUG designan el aminoácido leucina y los dos AGU y AGC la serina; en cambio, el triptófano queda designado por un solo codón, UGG.
                                                       
La mayor parte de los aminoácidos están determinados de manera casi unívoca por sus dos primeras bases y, en muchos casos, el tercer nucleótido es un complemento indiferente o designa otro aminoácido de una familia próxima. Esta propiedad contribuye a limitar las consecuencias de los errores de copia o lectura.
La forma en que la clave genética fue descifrada – como se determinaron los aminoácidos concretos representados por cada triplete- constituye una de la aventuras biológicas mas apasionantes en las ultimas décadas. Una vez que estuvieron disponibles las técnicas experimentales adecuadas, la clave genética se descifro en un suspiro.

Numero de letras de cada codón: se partió del hecho de que la clave debería ser de 3 letras; porque? Si la clave fuera de una letra (nucleótido : A, G, C, U) solo habría cuatro aminoácidos diferentes (4 letras diferentes). La clave genética no podría ser asi, pr que se necesitaría una distinta para cada uno de los 20 aminacidos!
Si la clave fuera de 2 letras, entonces seria posible 42 = 16; por ejemplo, AU, CU o CC, este vocabulario no seria todavía suficientemente variado.
Si la clave fuera de 3 letras, entonces seria posible 43 = 64; por ejemplo AUU, GCC o UGC. Esta clave ofrece mas combinaciones que las necesarias para los aminoácidos.
Y hacia 1961 parecía claro que estos codones no eran solapados.

 El primer paso para el desciframiento fue el descubrimiento de cómo fabricar RNAm sintético. Si los nucleótidos que conforman el RNA se mezclan con una enzima especial (fosforilasa de los polinucleotidos) se forma una cadena sencilla de RNA de la reacción. Esta síntesis no requiere ADN y los nucleotidos se incorporan al azar. La capacidad de sintetizar RNA habria la posibilidad de crear secuencias especificas de ARN y comprobar que aminoácidos se incorporaban al utilizarlas como RNAm.
El primer mensajero sintético obtenido, Poli(U), se fabrico mezclando solo nucleótidos de U, produciendo asi –UUUUUUUU-.
En 1961 Marshal Nirenberg y Heinrich Mathaei mezclaron in vitro Poli (u) y la maquina sintetizadora de proteínas de E. coli (Ribosomas, RNAt, energía, varias enzimas y algunas cosas mas) y observaron la formación de una proteína!! Resultando como secuencia de proteína ser una ristra de Fenilalanina. Así pues, el triplete UUU debe ser el codon de fenilalanina. 

Este tipo de análisis se amplio mezclando diferentes tipos de nucleótidos, en proporciones fijas conocidas. En un experimento los nucleótidos Uracilo y Guanina se mezclaron en razón 3:1. al incorporase los nucleótidos al azar en el RNAm sintético, la frecuencia relativa con la que aparece. hacia 1966 con Severo Ochoa ya se había descifrado los codones de los 20 aminoácidos.

                            

1.1. 2 El DESCUBRIMIENTO DE LA ESTRUCTURA DEL ADN.

Después de que el papel central del DNA en la herencia se hizo evidente, muchos científicos se dispusieron a determinar su estructura con exactitud. ¿Como puede una molécula con un rango tan limitado de componentes distintos almacenar la inmensa variedad informativa de las estructura de todas las proteínas de los seres vivos?
Los primeros que tuvieron éxito en descubrir la estructura fueron Watson y Crick en 1953 tuvieron en cuenta dos tipos de pistas. En primer lugar, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, habían acumulado muchos datos de difracción de rayos X sobre la estructura de DNA.
                             
El segundo tipo de datos procedía del trabajo de años antes de Edwin Chargaff. Estudio DNA de diferentes organismos, Chargaff estableció ciertas reglas empíricas sobre las cantidades de cada componente del DNA.
Erwin Chargaff:: Analizó la composición de bases de distintos organismos y encontró distintas proporciones de los 4 nucleótidos en cada uno de los organismos estudiados. También observó que esta composición no cambiaba con la edad ni el ambiente. Pero lo más importante es que había tantas purinas como pirimidinas en todos los organismos.
Las reglas de Chargaff son:
1.      La cantidad total de nucleótidos pirimidinicos (T + C) es siempre igual a al cantidad total de nucleótidos púricos (A + G).
2.       La cantidad de T es siempre igual a la de A y la cantidad de C es siempre igual a la de G. pero A + T no necesariamente es igual a C+G

En los primeros análisis de difracción de R-X realizados por Rosalyn Franklin se observaba que el DNA tenía un espaciado regular de 0,34 nm. Éste y otros indicios indicaban que debe tener algún tipo de estructura en hélice que se repite periódicamente, los datos sugerían que el DNA era largo y fino y que consta de dos partes separadas que corre una allado de la otra a lo largo de la molécula, también demostraba que la molécula era helicoidal.
Watson y Crick.: Construyeron un modelo que cumpliera todas las investigaciones que sobre el DNA se habían realizado hasta la fecha y propusieron, además, cómo tenía que conservarse y transmitirse la información de esta molécula. También introdujeron que esta molécula se podía mutagenizar espontáneamente mediante la tautomería. 
                                
Se pueden consultar los artículos publicados por Watson y Crick, Wilkins y Franklin en Nature el 25 de abril de 1953 para describir la estructura del DNA. También puedes leer las implicaciones que Watson y Crick dedujeron de la estructura del DNA publicadas el 3 de mayo del 53, así como la demostración experimental que Frankin aportó el 25 de julio del 53 para confirmar que la doble hélice era realmente así.

1.1 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.



                      1.1.1 El descubrimiento del principio transformante.

Como sabemos que los genomas están compuestos de DNA?
En el caso de los cromosomas nucleares eucarióticos, es relativamente sencillo demostrar este hecho mediante la utilización de pruebas histoquímicas y fisicas. Los colorantes que se unen al DNA, como Feulgen, tiñen principalmente los cromosomas nucleares y también mitocondrias y cloroplastos. Además si se fraccionan los componentes de una masa de células, se observa claramente que la mayor parte del DNA aparece en la fracción nuclear y el resto en las mitocondrias y cloroplastos.
Que el DNA es el material genético esta hoy día perfectamente demostrado en muchas procariotas y eucariotas. Pero  la demostración de ese hecho llevo a la realización de brillantes e ingeniosos experimentos.

                       *    EXPERIMENTOS DE GRIFFITH (1928)

El descubrimiento de la trasformación.
En 1928 en el transcurso de sus experimentos con la bacteria Streptococcus pneumoniae, Frederick Griffith había hecho una misteriosa observación. Esta bacteria humana causante de la neumonía humana, es normalmente letal para los ratones. Sin embargo, han aparecido diferentes cepas que difieren en su virulencia. Griffith utilizo en sus experimentos dos cepas que se distingan por la apariencia de las colonias crecidas en laboratorio. Las células de una de las cepas, de tipo virulento normal, están rodeadas por una cápsula de polisacáridos que le da a la colonia apariencia lisa (smooth en ingles); de ahí llamada estirpe S. Las células de la otra cepa (un tipo mutante) no virulento que se reproduce en los ratones pero no es letal, carecen de esta cápsula de polisacáridos, lo cual hace que las colonias tengan apariencia rugosa; esta es la denominada estirpe R. 
                                           
Griffith mato algunas células virulentas, hirviéndolas e inyecto las células muertas en ratones. Los ratones sobrevivieron, demostrando así que las cápsulas de las células no provocan la muerte.
Sin embargo, ratones inyectados con una mezcla de células no virulentas vivas y células virulentas muertas, murieron. Además podían recuperarse  bacterias vivas de los ratones muertos; esta producían colonias lisas y en subsiguientes inyecciones eran virulentas. De alguna manera, los restos celulares de las células S hervidas habían convertido a las células S vivas. Este proceso se denomina transformación.

Los experimentos de Griffith demostraron que la transformación ocurría por la absorción por parte decélulas vivas (estirpe R) de un “principio trasformante” que se encontraba en las células muertas (Estirpe S). Ese principio trasformante tenia la característica de producir una cápsula de polisacáridos (se expresaba) y producía además la muerte en ratones, en otras palabras estaban confiriendo propiedades hereditarias a la celula recipiente, ese principio trasformante se sabría después que eran moléculas de DNA.

Vídeo del experimento: "Transformación"

                                * EXPERIMENTOS DE AVERY Y COLABORADORES (1944)

Este mismo método básico se utilizó para determinar la composición  del “principio trasformante.
En 1944, Oswald Avery, C. MacLeod y M. McCarty separaron los distintos tipos de moléculas que se encuentran en las células S muertas y estudiaron su capacidad de transformación por separado. 
              
                                    

Estas pruebas demostraron, en primer lugar, que los propios polisacáridos no trasformaban a las células rugosas. Por tanto la cubierta de polisacáridos, aunque claramente implicada en la acción patogénica, es solo la expresión fenotípica de la virulencia. Tras el escrutinio de los diferentes compuestos (Polisacáridos, Lípidos, RNA, Proteínas y DNA), Avery y col. Descubrieron que solo DNA, inducía la transformación de las células R, dedujeron que el DNA es el agente que determina la aparición del polisacárido y, por tanto, del carácter patogénico. Es mas, parece ser que proveer  a las células R del DNA de las células S es equivalente a ¡proveerlas de los genes de las células S!!

                                                                   *  EXPERIMENTOS DE HERSEY Y CHASE (1952)

Los experimentos llevados a cabo por Avery eran definitivos, pero muchos científicos se resistieron a aceptar como material genético al DNA (y no a las proteínas). La prueba definitiva se obtuvo en 1952 por Alfred Hersey y Martha Chase, usando el fago (virus T2). su razonamiento fue que la infección del fago debe implicar la introducción dentro de la bacteria de la información que dicta la reproducción viral. El fago es relativamente simple en cuanto a la composición molecular. La mayor parte de la estructura de un fago es proteína, estando el DNA en el interior de la envuelta proteica o “cabeza”. En las proteínas no se encuentra fósforo, que si forma parte del DNA; inversamente, el azufre esta presente e las proteínas pero nunca en el DNA.         
                              
Hersey y Chase marcaron el DNA del fago con un radioisótopo del fósforo (P32)  y las proteínas con azufre (S35), en cultivos distintos de fagos. Usaron entonces cada cultivo por separado, para infectar E. coli con muchas partículas de virus por cada célula.
Tras dejar tiempo suficiente para que se produjera la infección, separaron de las células bacterianas las carcasas vacías de los fagos llamadas “fantasmas” mediante agitación con una batidora de cocina.
Separaron las células bacterianas de los fantasmas de los fagos, mediante centrifugación, y midieron entonces la radioactividad en las dos fracciones. Cuando se usaron los fagos con P32, la mayor parte de la radioactividad terminaba en las células bacterianas, indicando que el DNA viral entraba en las células. También podía recuperarse P32 de los fagos descendientes. Cuando se usaron fagos los fagos marcados con S35, la mayor parte de la radiactividad terminaba en los fantasmas virales, indicando que la proteína viral nunca entra en la célula bacteriana.
La conclusión es evidente!: El DNA es el material hereditario; las proteínas fágicas son meros empaquetadores estructurales que se desechan después de inyectar el vital  DNA en la célula bacteriana.

  
                       

¿Por qué tal reticencia en aceptar esta conclusión?? El DNA se consideraba un compuesto más bien simple. ¿Cómo podría una molécula tan simple almacenar toda la información que se requiere para la enorme variedad de estructuras proteicas? ¿Cómo podría trasmitirse tal información de una generación a la siguiente? Sin duda, el material genético debe poseer tanto la capacidad de poner en clave la información especifica como la de duplicar tal información precisa. ¿Qué tipo de estructura en una molécula tan simple, podría explicar unas funciones tan complejas?


Vídeo sobre el experimento de "Hersey y Chase"

UNIDAD I : INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR



INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR

El termino biología molecular fue utilizado por primera vez en 1945 por William Astbury para referirse al estudio de la estructura química y física de las macromoléculas biológicas.

La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos.
Este conocimiento ha permitido cruzar barreras naturales entre especies y colocar genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética. Una de las consecuencias  importantes derivadas, fue la producción de fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo las  puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores recombinantes. 

La Biología Molecular se ocupa entonces de la estructuras y funciones de las entidades de dimensiones inferiores a las de las células estudiadas en la biología clásica, pero superiores a las de moléculas, estudiadas por los métodos químicos tradicionales. Por lo tanto, trata de las bases moleculares que subyacen a los procesos biológicos.

                                 
William Astbury

TEMARIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR


Profesor: Francisco Javier Puche Acosta
Clave de la asignatura: BIC-0509
Horas teoría-horas práctica-créditos:  4-2-10

APORTACIÓN DE LA ASIGNATURA AL PERFIL DEL EGRESADO:
Comprender las bases moleculares que rigen el control de los procesos celulares como la expresión génica, la mutagénesis y reparación del ADN así como los mecanismos de transferencia, recombinación y técnicas para conocer su aplicación en la manipulación del material genético con fines biotecnológicos.

                                   OBJETIVO(S) GENERAL(ES) DEL CURSO
Entenderá las bases moleculares del control de la expresión génica y de la manipulación del ADN mediante el empleo de las diferentes técnicas moleculares que le permitan desarrollar proyectos de investigación básica y aplicada.

                                                            PROGRAMA

   Unidad            Temas                                Subtemas
1
Introducción a la Biología Molecular
1.1 El desarrollo de la Biología Molecular.
1.1.1 El descubrimiento del principio transformante.
1.1.2 El descubrimiento de la estructura del ADN.
1.1.3 El descubrimiento del código genético.
1.1.4 El modelo del operón.
1.2 La biología Molecular en México.
1.3 Perspectivas futuras de la Biología Molecular.

     Unidad                  Temas                              Subtemas
2
Estructura y propiedades del material genético
2.1 Estructura química y física de los ác.nucleicos: ADN y ARN.
2.2 Función de los ácidos nucleicos.
3
Organización del material genético
3.1 Organismos procarióticos:
3.1.1 ADN circular
3.1.2 Proteínas asociadas
3.1.3 ADN extracromosómico.
3.1.3.1 Plásmidos.
3.1.3.2 Bacteriófagos.
3.1.3.3 Transposones
3.2 Organismos eucarióticos:
3.2.1 ADN lineal y empaquetamiento
3.2.1.1 Histonas
3.2.1.2 Solenoides
3.2.1.3 Cromosomas
3.2.2 Complejidad del genoma
3.2.3 ADN mitocondrial.
3.3 Organización genómica viral.
4
Replicación del ADN
4.1 Replicación del genoma procariótico
4.2 Replicación del genoma eucariótico
4.3 Control genético de la replicación.
4.4 Replicación in vitro del ADN (PCR)
4.4.1 Secuenciación del ADN
5
Reparación del material genético
5.1 Clasificación de los tipos de lesión al ADN
5.1.1 Lesiones espontáneas
5.1.2 Lesiones inducidas
5.1.2.1 Fijación de la lesión (mutación)
5.1.2.2 Agente mutagénicos
5.1.3 Físicos
5.1.4 Químicos.
5.2 Sistemas de reparación.
6
Transcripción genética
6.1 Organismos procarióticos:
6.1.1 Etapas de síntesis del ARN.
6.2 Organismos eucarióticos:
6.2.1 Etapas de síntesis del ARN.
6.2.2 Modificaciones postranscripcionales del RNA mensajero
  
   Unidad            Temas                                               Subtemas
7
Traducción del ARN mensajero
7.1 El código genético
7.2 El papel del ARN en la síntesis de proteínas.
7.2.1 Tipos de ARN.
7.2.2 Estructura ribosomal.
7.2.3 Procariótico
7.2.4 Eucariótico
7.3 Etapas de la síntesis de proteínas en org.  procarióticos.
7.4 Etapas de la síntesis de proteínas en org. eucarióticos.
7.4.1 Modificación de proteínas postraducción

8
Regulación de la expresión genética
8.1 Niveles de regulación de la expresión genética.
8.2 Regulación de la transcripción en organismos procarióticos.
8.4.1 Operon de Lactosa (Control positivo).
8.4.2 Operon de Triptofano (control negativo).
8.3 Regulación de la transcripción en organismos eucarióticos.


9
Transferencia del material genético.
9.1 Mecanismos de transferencia natural:
9.1.1 Transformación.
9.1.2 Conjugación.
9.1.3 Transducción.
9.1.4 Recombinación.
9.1.5 Transfección.
9.2 Mecanismos de transferencia artificial:
9.2.1 Físicos
9.2.2 Químicos
10
Técnicas de la biología molecular
10.1 Métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos.
10.2 Técnicas de hibridación.
10.3 Técnicas de clonación de genes.
10.4 Prueba de PCR en el diagnostico de enfermedades
10.5 Genéticas
10.6 Por microorganismos (bacterianas, protozoarios, entre otros)
10.7 Tecnología del ADN recombinante.

           CRITERIOS A EVALUAR EL CURSO:

            EXAMEN……….. 50 %
            TRAB INVES…….30 % (EN LINEA…PORTAFOLIO EVIDENCIAS)
            PUNTUALIDAD…10 %
            ACTITUD………...10 %
                                           100 %