PRÁCTICA NUMERO 1: EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE DNA

RESUMEN

ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico. Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.

El ADN fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, biólogo suizo, en los núcleos de las células del pus obtenidas de los vendajes quirúrgicos desechados y en el esperma del salmón. Él llamó a la sustancia nucleína, aunque no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery

La estructura del ADN es una pareja de largas cadenas de nucleótidos. La estructura de doble hélice del ADN fue descubierta en 1953 por James Watson y Francis Crick. Una larga hebra de ácido nucleico está enrollada alrededor de otra hebra formando un par entrelazado. Dicha hélice mide 3,4 nm de paso de rosca y 2,37 nm de diámetro, y está formada, en cada vuelta, por 10,4 pares de nucleótidos enfrentados entre sí por sus bases nitrogenadas. Por medio de la realización de la práctica se pudo hacer este trabajo el cual, nos enseña y aprendimos a como extraer ADN y a como separarlo por técnicas sencillas. Con ayuda del manual de práctica pudimos realizar los pasos y hacer posible dicho trabajo

ABSTRACT

DNA stands for deoxyribonucleic acid. Is the genetic material of organisms. It is theprimary chemical component of chromosomes and the material of which genes are made.

DNA extraction requires a series of basic stages. First they have to break the cell wall and the plasma membrane to access the cell nucleus. Then you must alsobreak the nuclear membrane to free DNA. Finally we should protect DNA fromenzymes that can degrade and isolate it needs to be done to precipitate in alcohol.

The DNA was first identified in 1868 by Friedrich Miescher, Swiss biologist, in the nuclei of pus cells obtained from discarded surgical bandages and salmon sperm.He called the substance nuclein, but was not recognized until 1943 thanks to theexperiment by Oswald Avery.

The DNA structure is a pair of long chains of nucleotides. The double helix structureof DNA was discovered in 1953 by James Watson and Francis Crick. A longnucleic acid strand is wound around another strand forming a twisted pair. Suchmeasures 3.4 nm helix pitch and 2.37 nm in diameter, and consists, at every turn,by 10.4 nucleotide pairs facing each other by their nitrogenous bases. Through the implementation of practice could make this work which, we are taughtand learned how to extract DNA and separate it as simple techniques. Using themanual we were able to practice the steps and make such work possible.

ÍNDICE.

Antecedentes

Definición del problema.

Objetivo  General

Objetivos Específicos

Justificación.

Fundamento teórico

Materiales y Métodos.

Resultados.

Conclusiones y Recomendaciones.

Fuentes consultadas

Anexos. 

ANTECEDENTES

Además del agua, los carbohidratos, las proteínas y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, en menos cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

Los ácidos nucleícos (DNA y RNA) Son biomoleculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas. Son moléculas complejas producidas por las células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características específicas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteínas.

La extracción de ADN de los tejidos de las plantas, a diferencia de aislamiento de ADN de tejidos de mamíferos, sigue siendo difícil debido a la presencia de una pared celular rígida que rodea las células vegetales. Actualmente se utilizan métodos exigen necesariamente una laboriosa trituración mecánica paso, necesario para interrumpir la pared celular para la liberación de ADN. El campo de la biología molecular de plantas es, por lo tanto, en una situación de desventaja, especialmente cuando un sistema automatizado de alto rendimiento para el sistema de aislamiento de PCR-Ready se requiere el ADN genómico en la genética de poblaciones, la identificación de las especies, la diversidad biológica de investigación, la selección de detección, de control de los alimentos y la biotecnología vegetal. QIAGEN GmbH ha desarrollado un 96-así moler método (MagAttract 96 Planta kit), pero se requiere de un molino mezclador especial, un paso centrifugación y, en consecuencia, no está plenamente automatable

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

En los organismos superiores el ADN es único e invariable, a lo largo de toda la vida, para cada individuo de cada especie. Esta característica es lo que se conoce como "huella genética", y es la base de los estudios de identificación de individuos. Salvo unas pocas excepciones (glóbulos rojos en mamíferos, por ejemplo), todas las células de un organismo vivo tienen ADN. Gracias a ello es posible extraerlo a partir de cualquier muestra biológica.

OBJETIVO GENERAL

Extraer DNA y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

• Utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto natural.
• Observar la estructura del ADN 

JUSTIFICACIÓN.

Esta práctica se realizo con el fin de extraer ADN, y también para poder conocer técnicas sencillas para dicha extracción, y conocer para que es importante extraerlo.Ya que como estudiante de Biología, es indispensable conocer como se extrae el ADN y como es dicho proceso, ya que esto nos beneficiara en las siguientes practicas que tendremos y a futuro en nuestra carrera.

FUNDAMENTO TEÓRICO

La práctica se realizo mediante un manual que el profesor nos proporciono, este se basaba de varios pasos que nos guiaban a como realizar esta práctica, y esos son los siguientes:

A) Rompimiento de membranas y pared celulares.

Toma una muestra del tejido (5 gr Aprox) que hayas eligido y homogenízalo, es decir muelelo con el mortero, si el tejido es muy duro, si el tejido es muy duro licualo en seco.

B) Digestion

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox),  en un tubo de eppendorf de 1 ml y agrégale el Buffer de extracion (Tris- HCL 0.05 M, EDTA, 0,02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7 M)  a temperatura de cuarto (500 ul aprox).

Cuando hayas agregado el Buffer de extracción a tu muestra, agítala e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

C) Separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agrégale 500 ul. de Fenol/Cloroformo/Isopropanol frio usa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 min.

Extrae la fase acuosa (500 ul.) con una micropipeta, si no se separan las fases centrifuga a 3000 rpm por 10 min, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

D) Precipitación de Ácidos nucleicos DNA y RNA

A la fase acuosa que extrae (500 ul), colocala en un tubo de eppendorf limpio y agrégale 400 ul de etanol (100 %) frio y 75 ul de NaCl 3 M. Mezcla por inversión, suave y observa como se precipita el DNA.

D) Recuperacion de la pastilla.

Centrifuga tu tubo por 5 min a 3000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.

E) Resuspension.

Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Los materiales que se ocuparon para realizar la practica son los siguientes:

*Tubos de centifruga 1ml

*Tubos de ensayo de 5ml

*Centrifuga

*MicroPipetas de 1000 y 200 ul

*Agua Destilada estéril (20 ml para todos)

*Etanol al 100% frio (20 ml para todos)

*NaCl 3M

*Buffer de extracción de ADN (Urea, Nacl, EDTA, (20 ml para todos)

*Fenol/Cloroformo/Isopranol frió. (20 ml para todos)

*Mortero y pistilo

*Aguacate, cacahuate, hojas, carne, hígado, sangre.

*Papel aluminio

*Ceenpack

*Guantes
En cuanto al método que nos basamos en realizar fue con la ayuda del manual que nos proporciono el profesor para dicha practica.

RESULTADOS

A) Rompimiento de membranas y pared celulares.

Toma una muestra del tejido (5 gr Aprox) que hayas eligido y homogenízalo, es decir muelelo con el mortero, si el tejido es muy duro, si el tejido es muy duro licualo en seco.

B) Digestion

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox),  en un tubo de eppendorf de 1 ml y agrégale el Buffer de extracion (Tris- HCL 0.05 M, EDTA, 0,02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7 M)  a temperatura de cuarto (500 ul aprox).

Cuando hayas agregado el Buffer de extracción a tu muestra, agítala e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

C) Separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agrégale 500 ul. de Fenol/Cloroformo/Isopropanol frio usa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 min.

Extrae la fase acuosa (500 ul.) con una micropipeta, si no se separan las fases centrifuga a 3000 rpm por 10 min, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

D) Precipitación de Ácidos nucleicos DNA y RNA

A la fase acuosa que extrae (500 ul), colocala en un tubo de eppendorf limpio y agrégale 400 ul de etanol (100 %) frio y 75 ul de NaCl 3 M. Mezcla por inversión, suave y observa como se precipita el DNA.

D) Recuperacion de la pastilla.

Centrifuga tu tubo por 5 min a 3000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.

E) Resuspension.

Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.

En conclusión, puedo decir que con la realización de esta práctica se cumplió con los objetivos, ya que se extrajo DNA y RNA de tejidos animales y lo identificarlos como tales. También utilizamos unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un producto natural. Y observar la estructura del ADN. Una recomendación seria que cuando se añade el alcohol frío se  debe hacerlo de forma cuidadosa y no inhalar los vapores ya que este es dañino para la salud y conlleva graves consecuencias.

FUENTES CONSULTADAS

http://www.educ.ar/educar/tecnologia-del-adn-recombinante.html 

http://www.geneticaycancer.es/doc.phpop=molecular&ap=tecnicas_molecular&id=8 

ANEXOS

CUESTIONARIO

1. ¿Porque el DNA en solución se precipita en presencia de un alcohol frió?

Porque la solución forma complejos con los lípidos y las proteínas, permitiendo que los mismos sean separados del ADN por filtración. Así se libera el ADN. La sal permite que el ADN precipite en una solución fría de alcohol y que las cadenas de ADN no se corten. 

2.¿Como separamos de nuestra muestra el DNA del RNA?

Por medio de la centrifugación.

3.¿Cuál es la función del Cloroformo?

La separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos.

4.¿Cómo podrías cuantificar la cantidad de DNA de tu muestra?

La cantidad de ADN leído se mide en número de bases nucleotídicas, así se pueden encontrar unidades de medición como las "kilobases" (una kilobase = mil bases de ADN leídas).

5. ¿Cuál es su función y la importancia del DNA en los organismos?

La importancia del ADN se deriva de sus funciones y algunas de ellas son:

Almacenamiento de información (genes y genoma )

Codificación de proteínas (transcripción y traducción ) 

Autoduplicación (replicación del ADN ) para asegurar la transmisión de la información a las células hijas durante la división celular.  El ADN controla la actividad de la célula.

Y en ciertos casos, comúnmente derivados del caso anterior, el ADN puede llegar a tener cierta conductividad, según un estudio realizado.