INTRODUCCIÓN

La Biología Molecular es una ciencia que se encuentra en continua evolución gracias a la aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de Ingeniería Genética y referidas como clonación, DNA recombinante o manipulación genética entre otras.  Antes del desarrollo de la Ingeniería Genética, no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto mas sin embargo en la actualidad hoy ya se es posible, gracias a los avances de las técnicas de Biología Molecular.                              

Las técnicas de Biología molecular, propiamente dicho son técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas, corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción entre otras.                            

En esta unidad numero 10, conoceremos dichas técnicas de Biología Molecular, algunas de las que veremos en el transcurso de las clases serán:    

Métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleícos, la técnicas de hibridación, la técnicas de clonación de genes, la prueba de PCR en el diagnostico de enfermedades, también veremos las técnicas genéticas, técnicas  por microorganismos como bacterianas o, protozoarios, y también la tecnología del ADN recombinante. Conoceremos que son dichas técnicas, para que nos son útiles, y las aplicaciones que nos brindan.

OBJETIVO

Ë  Conocer y aplicar las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, médico y ecológico.

METODOLOGÍA

La metodología que utilizare en mi portafolio de evidencias de trabajo, así como mis tareas, resumen de las clases, e investigaciones. Serán conforme a los días de clases. Por ejemplo un día Martes en la clase, el profesor nos habla de la Técnica de PCR, ese mismo día, o al dia siguiente visto el tema, subiré información sobre el tema mencionado. Cuando el profesor, programe una fecha para entregar un trabajo de investigación, y se llegue el día de entrega, subiré mi trabajo realizado. Cuando el profesor, nos deje algún ejercicio en clase, tomare evidencias "Fotografías" Para tenerlas vista en mi portafolio de evidencias, y así mismo comprobar mis trabajos. De igual  manera serán los exámenes aplicados. Ahora bien, la metodología que utilizare para poder aprobar la unidad numero 10 con una buena nota serán; Primeramente, asistir a todas las clase, llegando puntual, prestar atención a los temas, cualquier duda o pregunta que tenga, preguntársela al profesor. Cuando deje un trabajo de investigación, revisaré diferentes bibliografías actuales para presentar un buen trabajo. También si es necesario discutiré la información encontrada con mis compañeros de clase, o con el profesor. Realizare esquemas o cuadros sinópticos para poder entender a manera de dibujos los conocimientos adquiridos.

EVIDENCIAS

Examen de la unidad numero 9 "Transferencia del Material Genético"

PORTADA

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CD. ALTAMIRANO GRO

LIC: BIOLOGIA

MATERIA:

BIOLOGÍA MOLECULAR

UNIDAD NUMERO 10

"TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA

 MOLECULAR"

NOMBRE DE LA ALUMNA:

ALEXA MOLINA VALENZUELA

09930047

SEMESTRE Y GRUPO:

Vl SEMESTRE “A”

NOMBRE DEL PROFESOR:

FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

CD.ALTAMIRANO, GRO     JUNIO/2012 

TAREA DE LA UNIDAD NUMERO 9

¿Las bacterias de diferentes especies, pueden compartir plásmidos mediante la transformación? Si, no, y porque? Mencione Ejemplos..

La respuesta a la pregunta es un SI, porque como sabemos algunas bacterias son capaces de incorporar de manera natural ADN, bajo condiciones de laboratorio; y muchas más pueden ser capaces de hacerlo en sus ambientes naturales o incluso pueden tomar los plásmidos que han sido liberados a partir de la destrucción de otras bacterias, y así adquieren plásmidos del ADN de diferentes especies.
Se necesitan determinadas condiciones de fragmentos de ADN exógeno o ADN transformante con estructura helicoidal intacta para poder unirse a células bacterianas competentes y entrar en su interior

Estas especies traen un conjunto de maquinaria genética específica para llevar el ADN a través de la membrana o membranas. Las bacteria además de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos.  

El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosa para la sobre vivencia de la bacteria.  En la naturaleza las bacterias pueden transferir plasmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes.

Ejemplo:

La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme  utilidad, que nos permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. Uno de los métodos es, por su simplicidad, uno de los más  utilizados para transformar  E. coli. Para detectar la  transformación, el DNA  introducido llevará un marcador seleccionable en el medio adecuado.

Dicho método consiste en introducir el plásmido recombinante obtenido  en una reacción de ligación en la estirpe de Escherichia coli DH5α. Esta estirpe  está modificada genéticamente de manera que es posible inducir en laboratorio  la competencia de las células así como mantener el plásmido de forma estable  en su interior.  

Ejemplo:

En un laboratorio se utilizó un procedimiento que transformo la bacteria E. coli con un gen que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP).  Este gen fue extraído de una medusa o “agua viva” que es fluorescente y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria.  La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gen de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta.

Bibliografía:

http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/TRANSFORMACI%C3%93N%20%20%20BACTERIANA.htm

Transformación de Escherichia coli con un  plásmido recombinante  Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José  Javier Higuera, Emilio Fernández Reyes  Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,  Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

TAREA DE LA UNIDAD NUMERO 8

Investigue: ¿Cómo se realiza el control Génico del Gen BRCA?

Para contestar dicha pregunta primeramente es necesario tener en cuento que es el Gen BRCA.. Este, es un gen humano del tipo de los gen supresor de tumores, que regulan el ciclo celular y evitan la proliferación incontrolada.  Las variaciones de este gen están implicadas en algunos tipos de cáncer, especialmente el cáncer de mama.

La función de los genes BRCA es mantener el crecimiento normal de las células mamarias y prevenir la multiplicación de las células cancerosas. Pero cuando estos genes contienen las mutaciones que se transmiten de generación en generación, no funcionan normalmente y puede aumentar el riesgo de cáncer de mama. Los genes anómalos BRCA1 y BRCA2 pueden representar hasta el 10 % de todos los casos de cáncer de mama, o 1 de cada 10 casos.

El gen BRCA-1 está situado en el brazo largo (q) del cromosoma 17

                                                       

El gen BRCA-2 está situado en el brazo largo (q) del cromosoma 13

El gen BRCA1 se expresa en distintos epitelios del organismo durante el desarrollo, y su expresión se ve aumentada durante el embarazo y disminuye tras el parto. Se ha observado que el BRCA1 es inducido por estrógenos. La inhibición del BRCA1 causa un aumento de la proliferación de células de epitelio mamario tanto normales como cancerosas. En los cánceres de mama hereditarios y en algunos esporádicos, se ha detectado una menor expresión de la proteína BRCA1 normal. Al inocular células humanas de cáncer de mama a ratones se ha observado que el gen BRCA1 es capaz de inhibir el desarrollo de tumores, e incluso la expresión del gen elimina en ocasiones tumores preexistentes, alargando la vida de los animales. De acuerdo con esto la expresión del gen normal, pero no de las formas mutadas, inhibe el crecimiento de células tumorales de mama y ovario. La delección de los diez últimos aminoácidos de BRCA1 es suficiente para abolir su capacidad de inhibir el crecimiento tumoral. En tumores de mama de pacientes no seleccionadas por su historia familiar, la expresión de niveles bajos de BRCA1, que va desde un 50% de los valores del epitelio normal a su total ausencia, sugiere también un papel de la proteína BRCA1 en la inhibición del crecimiento celular aproximadamente la mitad de los tumores de mama y ovario de las portadoras de mutaciones presentan la pérdida de la copia normal del BRCA1, quedando sólo la forma que contiene la mutación heredada, esto es lo que se denomina la pérdida de la heterocigosidad (LOH). 

La pérdida de la heterocigosidad de manera constante en un mismo locus, utilizado como marcador genético en tumores de muchos pacientes, se ha considerado como una fuerte evidencia de la existencia de un gen supresor de tumores en esa región. El estudio de la LOH en familias con cáncer de mama sugiere que los cromosomas 8p, 16q, 17p, 17q y 19p presentan este fenómeno de pérdida de la copia normal del gen en al menos un 20% de los tumores examinados.

El cromosoma 17 contiene al menos tres genes supresores de tumores conocidos, BRCA1, NF1 y p53. El análisis detallado de este cromosoma sugiere la presencia de cinco regiones distintas de pérdida de cromosoma, p53 y BRCA1 son dos de ellas. Parece que la LOH en áreas específicas del cromosoma puede estar asociado con diferencias en las características clínicas de los tumores. En definitiva el análisis de la pérdida de la heterocigosidad puede ser de utilidad como herramienta genética en la identificación de genes supresores de tumores relacionados con el cáncer de mama.

Las mutaciones más frecuentes en el gen BRCA1 corresponden a delecciones o inserciones de bases que provocan un desplazamiento de la fase de lectura, originando muchas veces un codón de terminación que causa la producción de proteínas truncadas a las que les falta desde un 5% a un 99% de su secuencia de aminoácidos.

Bibliografía:

**Mazoyer S. (2005). «Reordenamientos genómicos en los genes BRCA1 y BRCA2». Hum Mutat. 25 (5): pp 415-22. doi: 10.1002/humu.20169. PMID 15832305

**http://www.breastcancer.org/es/sintomas/analisis/geneticas/resultados_positivos.jsp
**http://www.medspain.com/n6_sept99/cancer_mama.htm

CONCLUSION FINAL DE LA UNIDAD NUMERO 9

Como conclusión final, puedo afirmar que se cumplió con el objetivo planteado de la unidad, ya que en el transcurso de los temas entendimos las bases moleculares del intercambio del material genético entre los diferentes seres vivos para su aplicación.

Conocimos que existen varios mecanismos comunes de transferencia de genes los cuales fuimos viendo en cada clase.

Primordialmente para entender los mecanismos repasamos algunas generalidades básicas de las bacterias, como sus características, morfología, estructura, entre otras cosas, partiendo de ahí ahora si vimos principalmente los mecanismos de reproducción en bacterias, entre ellos los mecanismos de transferencia natural, en los que se encuentran: La transformación que cuando en determinadas condiciones fragmentos de ADN exógeno o ADN transformante con estructura helicoidal intacta pueden unirse a células bacterianas competentes y entrar en su interior. Otro mecanismo que vimos fue conjugación que es cuando una bacteria donadora transmite a través de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora, otro mecanismo que vimos fue la transducción que es cuando se trasfiere ADN de célula donadora a otra receptora mediante partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera, vimos también la recombinación que es cuando una bacteria receptora recibe genes de otra bacteria donadora, y por ultimo vimos el mecanismo de transfección que son técnicas que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción de ácidos nucleícos en el interior de las células.

Así como también aprendimos que existen  mecanismos de transferencia artificial, que se clasifican en Físicos y Químicos, en los químicos encontramos unas técnicas como la microinyección con una fina aguja de cristal y la electroporación que es una exposición de las células aun choque eléctrico y en los mecanismos químicos estudiamos algunos métodos que fueron: El Método del fosfato cálcico, Método del DEAE dextrano, Método DNA desnudo, Método Péptidos fusiogénicos, Método  de Liposomas.
Esta fue una de las unidades menos complicadas por las que no presente muchos problemas, y a manera futura, ya presento con algunos conocimientos sobre cuales son aquellos métodos de transferencia del material Genetico.

9.2.2 QUÍMICOS

Están basadas en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica fosfato cálcico, DEAE dextrano o a las membranas lipofección

Uno de los campos de estudio más importantes de las técnicas de transferencia de genes, son los estudios realizados con los llamados vectores sintéticos también usados en técnicas de terapia génica, con tal de evitar los problemas derivados de la utilización de virus para la transferencia de genes.

Método del fosfato cálcico:

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución.

                         

                                                                 

Método del DEAE dextrano:

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes. 

Método DNA desnudo:

Técnica basada en fase altamente experimental es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
Los problemas que encontramos son que el DNA por ser estructura polar  tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para  1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactación. 

                                

Método Péptidos fusiogénicos:

Los  péptidos fusiogénicos surgen en una línea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.

Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.

                                        

Método  de Liposomas:

Los liposomas estan formados por DNA y lípidos no inmunogénicos cargados positivamente lípidos cationicos.

Se empezó a trabajar con lípidos no inmunogénicosados, ya que la organización de los lípidos en bicapa podría facilitar el paso a través de la membrana citoplasmática. Aunque estos lípidos no englobaban mucho DNA.
A raiz de esto se crearon los liposomas que superan el problema de la compactación debido a que el DNA se contornea como consecuencia de las cargas positivas de lípidos (en los liposomas DNA está ocho veces más condensados que en  lípidos normales). Además se pretende controlar su destino mediante proteinas en membrana de liposoma. Una característica en común con la anterior es que se forman de forma espontanea si se colocan los dos en un mismo medio.

Bibliografía:

Metodos quimicos para la transformacion de plantas. Bayardo parra alferez cod. 90022151141  facultad de ciencias basicas biotecnologia vegetal

9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL:

9.2.1 FÍSICOS

Los métodos físicos utilizan técnicas como la microinyección con una fina aguja de cristal y la electroporación exposición de las células aun choque eléctrico.

La microinyección:

Es una técnica muy potente y eficaz, ya que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma permanente. El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar una célula cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia médica debido a que es demasiado laboriosa como para obtener un número de células indicadas  para que el tratamiento tenga éxito.

Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.

                                          

La electroporación:

Es una técnica que crea o que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA durante unos pocos segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o grupo de células sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidas en un medio rico en plásmidos, alguno de ellos puede penetrar en una célula. El problema que suscita este método es que los choques eléctricos no pueden producir los efectos deseados en algunas células y dañarlas o matarlas debido a esta causa.

                           

Bibliografía:

Bacchetti S, Graham F (1977). "Transferencia del gen de la timidina quinasa a la timidina quinasa deficientes en células humanas por purificó herpes simplex ADN viral». Proc Natl Acad Sci U S A 74 (4). 1590-4.